Clonación molecular

La clonación molecular es una herramienta utilizada para la construcción de bibliotecas de ácido desoxiribonucleico complementario (ADNc) y para la producción de proteínas de fusión. La aplicación de antígenos excreto-secretorios (ES) en lugar de antígenos crudos de larvas musculares en los ensayos de inmunoabsorbancia ligado a enzimas (ELISA) para el diagnóstico de la trichinellosis, mejoró la especificidad y sensibilidad de la prueba (Gamble y col,1983). La purificación de productos ES provenientes de cultivos de larvas musculares de Trichinella spp. no permite obtener cantidades suficientes de proteínas para su utilización en pruebas inmunoenzimáticas. Con el objetivo de mejorar esta contingencia se aplicaron las técnicas de clonación molecular. Vassiilatis y col. en 1996 clonaron y expresaron ADNc codificante para una glicoproteína secretoria de 43 kDa de T. spiralis. Yao y col. en 1997 obtubieron ADNc codificantes para ES con peso molecular de 46, 49/43 y 53 KDa de T. spiralis y proteínas de fusión provenientes de los mismos Las posibles aplicaciones de ES recombinantes y su caracterización molecular son: 1- Desarrollo de técnicas inmunoenzimáticas para el diagnóstico serológico de Trichinellosis. Yao y col. en 1997 desarrollaron un ELISA utilizando antígenos recombinantes de 45-50 kDa de T. spiralis y Trichinella T5, detectando elevados niveles de anticuerpos en cerdos infectados con T. spiralis al comienzo de las 2 semanas post inoculación (PI) y continuando hasta las 8 semanas PI. En animales infectados con Trichinella T5 no se detectaron niveles de anticuerpos hasta las 5 semanas PI. 2- Investigación de candidatos vacunales. El gen (TspE1) que codifica para un antígeno de T. spiralis de 31 kDa se clonó dentro de un plásmido para expresión en células eucariotas con el fin de desarrollar una vacuna ADN, la habilidad de expresar antígeno en células ováricas de hamster (CHO) se confirmó por ensayos de inmunoblot e inmunofluorescencia indirecta. Se comprobó la inmunogenicidad protectiva de la misma en ratones BALB/c. (Wang y col. 2006) 3- Generación de anticuerpos anti proteínas de fusión en estudios inmunohistoquímicos con la finalidad de esclarecer el lugar y momento del estadío evolutivo del parásito en que se secretan los ES. Ensayos de inmunocitolocalización demostraron que un suero anti proteína de fusión solo reconoció epitopes en esticocitos de T. pseudospiralis y no de T. spiralis. (Chung y Ko, 1999) 4- Generación de anticuerpos para su utilización en la identificación de clones recombinantes. En el presente capítulo se describe la metodología para la obtención de proteínas recombinantes