Hibridación fluorescente in situ

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FISH metafásico en humanos. En amarillo, el cromosoma 2.

FISH o hibridación fluorescente in situ es una técnica de marcaje de cromosomas mediante la cual los cromosomas son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y que gracias a ello permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética).

Los cromosomas que son usualmente utilizados con FISH son los 13, 18, 21, X e Y; sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas.

El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a regiones específicas. Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto).

La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase.

FISH interfásico en ratón.

FISH en metafase

En metafase se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son cósmidos,satélites alfas y sondas completas (painting probes).

• Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de microdeleciones.
• Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores.
• Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma

FISH en interfase

No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH. Normalmente, cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra en interfase, con los cromosomas descondensados. A pesar de ello, es posible realizar el FISH aunque los resultados obtenidos no sean tan específicos. Se emplea sobre todo para la detección de aneuploidias o grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales o tumorales.

Otros tipos de FISH

Además del FISH múltiple, está el FISH en hebra y el FISH inverso. El FISH en hebra es un FISH en el que se extiende linealmente en un porta el fragmento de cromosoma que nos interesa estudiar; permite distinguir pequeñas reorganizaciones sin tener que clonar y secuenciar, esta técnica se usa bastante para detectar deleciones en clones o para estimar huecos en los proyectos de genoma.Por su parte, el FISH inverso es una técnica que se usa mucho para determinar la procedencia de un cromosoma marcador. Consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de un porta donde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se encuentran teñidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A continuación, ponemos los cromosomas de un donantes sin anomalías en un porta y añadimos la sonda preparada. Esperamos ver que hay hibridación de la sonda (cromosoma marcador) con alguno de los cromosomas del donante por complementariedad en su secuencia. Así, podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida.

Aplicaciones

Esta técnica ha resultado ser muy útil en el campo de la Medicina Reproductiva, con aplicación en el diagnóstico genético preimplantatorio (DGP). Resulta una forma muy precoz de diagnóstico que, apoyándose en las técnicas de reproducción asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser transferidos al útero materno y, por consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantación embrionaria.

Para el análisis de anomalías cromosómicas embrionarias, tanto numéricas como estructurales, puede utilizarse la tácnica DGP-FISH. Para este fin se requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una célula del embrión en cultivo "in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el núcleo en interfase y se hibrida con sondas específicas para el estudio cromosómico de la patología que se sospecha pueda estar presente en el embrión.

Entre las anomalías cromosómicas que pueden ser analizadas, caben citarse:

• Anomalías numéricas.-

• Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica que, en muchos casos, sólo se den defectos leves en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir asociado, en mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos de síndrome de Klinefelter, trisomía X y monosomía X.

• Edad materna avanzada, aborto de repetición de causa desconocida y/o fallo de implantación: Más de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos, la selección de aquellos embriones normales para los cromosomas citados, aumenta las probabilidades de conseguir una gestación a término.

• Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar las alteraciones cromosómicas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a la técnica de microinyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI).

• Anomalías estructurales.-

Surgen espontáneamente, en la mayoría de los casos, como consecuencia de un fallo de meiosis durante la oogénesis o espermatogénesis, en los casos en que los padres presentan cariotipos normales. Algunas veces, algún miembro de la pareja puede ser portador de una anomalía estructural equilibrada, que podría transmitir a su descendencia. De esta manera, por medio del estudio genético específico de embriones de la pareja portadora, podrían distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromosómicamente de los equilibrados. Un vez hecha esta selección de embriones, podrían transferirse con total tranquilidad al útero materno los embriones que no presentan la alteración génica.

Múltiple FISH

El ‘’FISH Multicolor’’, ‘’M-FISH’’ o ‘’SKY’’ (Spectral Karyotiping) es una adaptación del FISH que permite la visualización de los 23 pares de cromosomas a la vez, teñidos con diferentes sondas fluorescentes. Para “colorear” los cromosomas, dado que sólo hay 5 colores distintos posibles, se puede usar la sonda de un color concreto, o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. Cada cromosoma es coloreado completamente por la sonda que se le une. Un programa informático se encarga de analizar las imágenes y formar el cariotipo: organiza los cromosomas de acuerdo a la emisión de las sondas que tiene integradas y las combina hasta dar las 23 combinaciones. Se utiliza con frecuencia en el estudio de células tumorales. El poder de dicho método reside en su habilidad para:

• determinar rápidamente si hay algún cromosoma extra en el cariotipo y de qué cromosoma se trata porque se ve el cromosoma extra de un color que equivale al color del cromosoma del que parte.
• determinar si está presente algún cromosoma translocado y qué cromosomas están implicados en la translocación por el mismo motivo de antes.
• permite la rápida identificación de material cromosómico de un cromosoma que haya sido insertado en otro cromosoma por la variación del color del fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma.
• ayuda en gran manera a la identificación de cromosomas pequeños o fragmentados que frecuentemente implican el problema de averiguar de qué cromosoma son originarios.

Estas aplicaciones del SKY se deben a que cada cromosoma está teñido completamente de un único color (de una única sonda) y por eso, viendo el color que van a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que anomalía presenta el paciente.