Un knockout de un gen ( gen knock-out) es una técnica genética que consiste en bloquear la expresión de un gen específico en un organismo (un ratón, una planta, una levadura...), sustituyendo el gen original en su locus por una versión modificada del mismo, a la que se ha extraído uno o varios exones para generar una versión no funcional, incapaz de producir la proteína que codificaba el gen original.^{[1] [2]}

Procedimiento para generar blastocitos de genotipo mixto.

El gen modificado se introduce en un plásmido, para generar un vector direccionador (targeting vector). En dicho vector, el gen modificado está controlado por un promotor que permite la expresión del gen de forma bien constitutiva (continua durante todo el desarrollo del animal), bien condicional (dependiendo de la presencia o no de una sustancia concreta que actúa como activador o inhibidor, como la tetraciclina; ello permite expresar el gen únicamente en una etapa del desarrollo o en un tejido concreto). Además, en el vector direccionador el gen modificado está flanqueado por fragmentos de los brazos cromosómicos colindantes del locus del gen de interés (en posición 5' y en posición 3'). Tanto el gen de interés como los brazos cromosómicos se obtienen a partir de un fragmento del genoma de la zona correspondiente, por ejemplo a partir de un BAC; el gen de interés se modifica mediante técnicas de biología molecular, y los tres componentes (el gen modificado y los brazos) se introducen (se subclonan) en el plásmido. Asimismo, el plásmido debe incluir la presencia de un marcador (normalmente la resistencia a un antibiótico) que permita seleccionar las células que han incorporado el gen modificado. Hay diferentes variantes de plásmidos disponibles, en función de la técnica concreta que se vaya a utilizar para crear el vector direccionador.

Esquema de cruces para obtener ratones knockout. Blastocitos que contienen células tanto no modificadas como knockout, se inyectan en el útero de una madre portadora. Ésta produce una descendencia que es bien tipo salvaje (no modificados, del mismo color que el blastocito donante (gris)) o bien es una quimera (mezcla) (parcialmente knockout). Los ratones quimera se cruzan con un ratón normal gris. Este cruce produce una descendencia de ratones blancos (heterocigotos para el gen knockout) o bien grises (normales). Los ratones blancos heterocigotos se cruzan luego entre sí para obtener ratones que son homocigotos para el gen knockout.

Una vez construido el vector direccionador (un proceso complejo que puede implicar varios meses de trabajo), éste se añade a un cultivo de células embrionarias ES (stem cells, células madre), y se incorpora a las células mediante transfección. El vector direccionador puede reconocer (por apareamiento de bases) la zona del locus de interés, de manera que mediante el mecanismo de recombinación homóloga, se puede producir un intercambio entre el vector direccionador (que recibe el gen endógeno) y el locus genómico (que recibe el gen modificado no funcional). Por este motivo, cuanto más largas sean las secuencias de los brazos de homología que flanquean al gen modificado, mayor será la probabilidad de que se produzca recombinación homóloga (y por tanto aparezcan células con el gen modificado), aunque eso aumenta la dificultad de construcción del vector direccionador.^[3]

Las células ES transfectadas se someten entonces a selección, utilizando el antibiótico correspondiente, de manera que sólo sobreviven las que hayan incorporado en su genoma el gen modificado (si el vector no se ha recombinado, se diluye tras un cierto número de divisiones celulares). Las células que sobreviven al proceso de selección se verifican mediante Southern Blot, una técnica de biología molecular que permite verificar la presencia de una molécula de ADN concreta en una muestra de ADN (el Southern blot combina la separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa con métodos para transferir los fragmentos de ADN separados por tamaño a una membrana, que se hibrida con una sonda específica para detectar la presencia de la molécula de interés).

Una vez verificado que las células embrionarias ES efectivamente han sustituido el gen endógeno (que ha sido extraído, de ahí el término knockout) por el gen modificado no funcional, algunas de estas células ES se inoculan a blastocitos, que son transplantados a hembras pseudopreñadas (en el caso de ratones). Los organismos knockout se utilizan para estudiar el rol funcional de un determinado gen por defecto, estudiando las diferencias entre el organismo knockout e individuos normales de la misma cepa.

Un organismo Knockin es igual al anterior pero en lugar de eliminar un gen determinado este es reemplazado por una versión modificada del mismo, que produce una variación en su función.

En 2007, Mario Capecchi, Martin Evans, y Oliver Smithies obtuvieron el Premio Nobel en Fisiología o Medicina por el desarrollo de técnicas de modificación genética específicas y tecnología de células madre embriónicas de ratón (células ES) que, combinadas, permitieron la generación de los ratones knockout. El análisis de estos animales mutantes ha revolucionado la elucidación de la función de los genes, y estos ratones han demostrado ser un valioso modelo de numerosas enfermedades humanas.^{[4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12]}

Referencias