Hibridación (biología molecular)

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La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A

Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión.

El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más , el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN, según que tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mit.

En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo northern, para uniones ADN-ARN.

Procedimiento experimental

1. La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte, como la sosa cáustica), esto rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.
2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.
4. La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias (más estables termodinámicamente) y se va formando una nueva molécula hibridada

La velocidad de hibridación es un indicativo de la similaridad genética entre las dos muestras, el porcentaje de similaridad genómica y la velocidad de hibridación es directamente proporcional.

Métodos de laboratorio

Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular.

Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

Southern

El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular.

El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas.

Northern

El segundo método, tipo northern o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para identificar ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

Hibridación in situ

Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio óptico de fluorescencia.

Chip de ADN

El siguiente paso en el desarrollo de técnicas de hibridación ha llevado a la miniaturización de los filtros de nitrocelulosa y a la utilización de matrices microscópicas en forma de chip de ADN. De esta manera se pueden colocar en una matriz una inmensa cantidad de copias génicas diferentes y mediante un proceso de hibridación detectar todas aquellas que tienen una secuencia parecida. modificando las características de las moléculas presentes en la matriz así como cambiando las sondas utilizadas, las posibilidades de análisis de expresión que proporcionan los Chip de ADN son enormes.

PCR

La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, utiliza un paso de hibridación de oligonucleótidos para completar el proceso. Entre el paso de desnaturalización de las hebras del ADN y antes del paso de extensión del cebador hay un paso de unión de los cebadores a la hebra de secuencia complementaria mediante una hibridación de ADN. Es el paso de menor temperatura de la PCR y el que marca la especificidad de la reacción