- Método de Sanger
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En 1975 Sanger, desarrolló el método de secuenciado del ADN, conocido también como método de Sanger. [ Dos años más tarde empleó esta técnica para secuenciar el genoma del bacteriófago A4, el primer organismo del que se secuenció totalmente su genoma. Realizó este trabajo manualmente, sin ayuda de ningún automatismo. Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos como el Proyecto Genoma Humano, y por él se le concedió su segundo Premio Nobel en 1980, que compartió con Walter Gilbert.
El método de secuenciación por dideoxinucleótido, mejor conocido como el método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del DNA. El método de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen de uno de los grupo hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no va a poder continuar elongándose. Esto es así ya que la DNA polimerasa necesita un terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo. El método comienza una vez se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra en la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador o “primer” que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.
A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de DNA de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargados en el gel y sometidos a electroforesis. En este experimento se realizó una simulación de este método con el propósito de conocer los procesos básicos de la replicación del DNA y de familiarizarnos con los procedimientos utilizados para parear la misma.
Enlaces externos
[1] Bioquímica. Escrito por Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, John Tymoczko. ( books.google.es ).
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