Partidor

Un partidor, cebador, iniciador o primer, es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Es una secuencia corta de ácido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde.

Se necesita un partidor porque la mayoría de ADN polimerasas, enzimas que catalizan la replicación del ADN, no pueden empezar a sintetizar una nueva cadena de ADN de la nada, sino que solo pueden añadir nucléotidos a una hebra preexistente. Se necesitan dos para la reacción de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra. Son de aproximadamente 20 nucleótidos, porque es la cantidad necesaria para que de manera probable se una a un sitio específico de la cadena de ADN.

En la mayoría de replicaciones del ADN, el principal partidor para la síntesis de ADN es una cadena corta de ARN. Este ARN lo produce una ARN polimerasa, y luego una ADN polimerasa lo elimina y lo sustituye con ADN.

Muchas técnicas de laboratorio en biología molecular que utilizan ADN polimerasas necesitan partidores; técnicas como la secuenciación de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los partidores usados para estas técnicas usualmente son moléculas de ADN cortas y sintetizadas de forma química, de aproximadamente veinte bases de longitud. La construcción de estos partidores empieza con nucleósidos de 3'-hidroxilo (fosforamidita) adheridos a un material llamado vidrio de poros controlados (CPG por su sigla en inglés). El 5'-hidroxilo de los nucleósidos es dimetoxitritilo (DMT) cubierto, lo que previene la construcción de una cadena de nucleótidos. Para añadir un nucleótido se remueve químicamente el DMT y se añade el nucleótido. El 5'-hidroxilo del nuevo nucleótido queda bloqueado por el DMT, lo que evita la adición de más de un nucleótido a cada cadena. Después de eso se repite el ciclo para cada nucleótido en el partidor. Esta es una descripción simplificada - el proceso en realidad es bastante complicado. Por esta razón la mayoría de laboratorios no construyen los partidores sino que los compran a empresas especializadas.

La secuenciación de ADN se usa para determinar los nucleótidos en una cadena de ADN. Un método de secuenciación llamado secuenciación didesoxi, conocido también como método de terminación de cadenas o método Sanger, usa un partidor como marcador de inicio para la reacción de cadena.

En la reacción en cadena de la polimerasa se usan partidores para determinar el fragmento de ADN que será amplificado en el proceso. La longitud de los partidores no suele ser mayor de 50 nucleótidos (la longitud se mide en pares de bases, ya que el ADN usualmente es de doble filamento. La longitud del ADN de un solo filamento se mide en bases o nucleótidos), y son iguales al inicio y al final del fragmento de ADN que va a ser amplificado. Se adhieren a la hebra molde de ADN en estos puntos de inicio y fin a los cuales se une la ADN polimerasa y la síntesis de la nueva cadena empieza.

Replicación de ADN o síntesis de ADN es el proceso de copiado de una doble-cadena de molécula de ADN.

Replicación de ADN y primers de ARN. En el ángulo inferior izquierdo, se puede observar la ligazón del grupo hidroxilo.

Descripción

Se trata de secuencias sintéticas de oligonucleótidos que son utilizadas para reconocer por apareamiento complementario secuencias blanco en ADN de plantilla (en inglés DNA template), que consiste generalmente en ADN genómico. Comúnmente un par de iniciadores son usados en PCR para definir los extremos del producto que se desea amplificar, y a partir de ellos la DNA polimerasa utilizada inicia la polimeración en dirección 5' - 3'. También son utilizados en reacciones de secuenciación de ADN, donde se utiliza solo un iniciador sobre una concentración relativamente alta de ADN blanco, para polimerizar cadenas sencillas de diferente tamaño truncadas por dideoxinucleótidos (método de secuencia de Sanger) y así determinar las secuencia de bases nitrogenadas.

Como ejemplo si tenemos la siguiente secuencia de ADN de cadena doble a partir de la cual pretendemos amplificar por PCR un fragmento cuyos límites están indicados por el símbolo de mayor o menor, los primers a utilizar podrían ser como los siguientes:

Iniciador reverso (en inglés reverse primer)

3’-gaccaggacgctagat<-5’ ...5'-aggaggcgagatgtcgagtcggatcgaccagagcgacccacacaggaccaggacgctagatcga-3'... ...3'-tcctccgctctacagctcagcctagcaggtctcgctgggtgtgtcctggtcctgcgatctagct-5'... 5’->gaggcgagatgtcgga-3’

Iniciador hacia adelante (en inglés forward primer)

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ <-Secuencia amplificada

Nótese la direccionalidad del oligo, que corresponde a la situación química del azúcar y el grupo fosfato en la base nitrogenada final e inicial. La DNA polimerasa incorpora nucleótidos en dirección 5'-3'. Más detalles en el artículo PCR. Este es un ejemplo para mostrar el fundamento del funcionamiento de los iniciadores, y como tal, no hay sido considerados aspectos del diseño del iniciador como termodinámica del apareamiento, especificidad de la amplificación o interferencia de reacciones de interacción entre primers o intramoleculares (estructuras como bucles internos en la misma cadena).

Para calcular las secuencias óptimas de los iniciadores considerando estos aspectos mencionados anteriormente, se suelen utulizar algoritmos que calculen dichos factores conjuntamente y deducir la secuencia que probablemente apareará más eficientemente con el ADN blanco.

Diseño de partidores

La elección de la longitud de los partidores y de la temperatura a la que se derriten (T_m) depende de varias consideraciones. La temperatura de derretimiento de un partidor se define como la temperatura a la cual el 50% de esa misma especie de molécula de ADN forma una doble hélice estable y el otro 50% se separa en moléculas de un solo filamento. La temperatura de derretimiento requerida aumenta con la longitud del partidor. Los partidores que son demasiado cortos se anexarían en diversas posiciones en una larga plantilla de ADN, lo cual llevaría a copias no específicas. Por otro lado, la longitud del partidor está limitada por la temperatura requerida para derretirlo. Las temperaturas de derretimiento muy altas, es decir por encima de los 80 °C pueden causar problemas porque la ADN polimerasa es menos activa en esas temperaturas. La longitud óptima de un partidor generalmente está entre 20 y 30 nucleótidos con una temperatura de derretimiento de entre 55 y 65 °C. Hay muchas formas de calcular la temperatura de derretimiento de los partidores (A, G, C y T son el número de nucleótidos en el partidor, respectivamente. [Na⁺] es la concentración de Na⁺ en el tubo de PCR).

Método "GC"

Rápido y sencillo para partidores con más de 13 nucleótidos.

Método "ajustado a la sal"

Más preciso que el GC, para partidores con más de 13 nucleótidos.

Cálculo de pila de bases

El más preciso, pero complicado

donde

ΔH es la entalpía de las interacciones de pilas de bases ajustadas según factores de iniciación de hélice.

ΔS es la entropía de las interacciones de pilas de bases ajustadas según factores de iniciación de hélice y según las contribuciones de las sales a la entropía.

R es la constante universal de los gases

El paquete de software libre primou puede calcular la temperatura de anexión de acuerdo con el método de apilamiento de bases.

Un partidor no debería anexarse fácilmente a sí mismo u otros de su tipo, con lo cual se producirían bucles o pinzas. Esto podría entorpecer la anexión con la plantilla de ADN. Sin embargo, normalmente las pinzas son inevitables.

Algunas veces se usan partidores degenerados. Estos en realidad son mezclas de partidores similares pero no idénticos. Pueden ser convenientes si se va a amplificar el mismo gen de organismos, puesto que los genes mismos pueden ser similares pero no idénticos. El otro uso para los partidores degenerados es cuando el diseño de partidores se basa en la secuencia de proteínas. Como muchos codones diferentes pueden codificar un aminoácido suele ser difícil deducir qué codón se usa en un caso particular. Por ello la secuencia de partidores que corresponde al aminoácido isoleucina podría ser "ATH", por A de adenina, T de timina y H de adenina, timina o citocina, según el código genético de cada codón. El uso de partidores degenerados puede reducir ampliamente la especificidad de la amplificación por PCR. El problema puede resolverse usando PCR touchdown.

Enlaces extenos

• Wikimedia Commons alberga contenido multimedia sobre Replicación de ADN. Commons
• Designing Primers - A Checklist
• PrimerQuest - Design primers using the latest thermodynamic parameters
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• Real time PCR Primer design
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• TM calculation - by bioPHP.org.