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Criopreservación
La criopreservación es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80ºC y -196ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.
Contenido
Criopreservantes
Un criopreservante es un compuesto químico que permite la mantención de un tejido o de células por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los criopreservantes se catalogan de acuerdo a la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes.
Aplicación
Las concentraciones criopreservantes son lamentablemente tóxicas para el tejido a temperatura ambiente, por lo cual, en el procedimiento de congelado, se deben respetar ciertos tiempos de exposición del material a 4° C, para que el producto protector penetre el tejido sin alcanzar los niveles tóxicos referidos, antes del inicio del proceso de congelamiento propiamente tal. En el mismo sentido, cuando se procede a la técnica de descongelado, previo al uso del material, se lo debe someter a un lavado minucioso con medios nutritivos a concentraciones decrecientes del criopreservante, para su total eliminación evitando de esa forma los efectos tóxicos.
Criopreservantes
- DiMetil-Sulfóxido (DMSO): Es muy tóxico a temperatura ambiente, pero si se aplica a baja temperatura es el que posee mejor resultado.
- Polivinil pirrolidona (PVP): La PVP no tiene un movimiento rápido tisular (a través de los tejidos), por lo que se utiliza mucho en embriones.
- Glicerol: Muy utilizado para mantener enzimas entre los -5 a 4 ºC sin congelar.
- Etilenglicol
- Propanodiol (PROH)
Además se ha observado que la glucosa, la trealosa y otros glúcidos pueden actuar como criopreservantes naturales.[1]
Elementos de una unidad de criopreservación
Cámara de congelación
Como su nombre lo indica es la unidad que permite congelar o "criopreservar" la muestra biológica por largo tiempo, preservando al mismo tiempo su viabilidad. Un sistema controlado por computadora controla el grado de congelación del vapor del nitrógeno para evitar el deterioro de la célula por fenómenos osmóticos o por la cristalización del agua.
Unidad de almacenamiento
Es en donde se almacena la muestra después de que esta ha alcanzado la temperatura deseada. Ya en esta unidad a la muestra se le colocan gradillas adecuadas al volumen y al tipo de muestra.
La criopreservación es útil para las técnicas de reproducción asistida, a las cuales acuden parejas con problemas de fertilidad. Así se congela el semen del donante, con el fin de realizar varios intentos de fecundación del óvulo en el momento más adecuado.Criopreservación en reproducción asistida
Criopreservación de espermatozoides
Esta criopreservación va a resultar muy interesante a la hora de querer conservar muestras de pacientes que por ejemplo van a someterse a un tratamiento de quimioterapia. Como vamos a disponer de millones vamos a necesitar estandarizar el método. De esta forma, vamos a encontrar cuatro métodos: 1) Alicuotar en pequeños volúmenes con un igual de medio de congelación y sumergir en nitrógeno líquido. 2) Añadir el crioprotector y mantener 45 minutos a 4º previo a sumergir en nitrógeno. 3) Incubar a 4º y formar gotas sobre un bloque de CO2 sólido. 4) Incubar a 4º y mantener dos horas en vapores de nitrógeno. 5) Usar un congelador biológico programable. A pesar de la existencia de cuatro métodos, sólo a partir del tercero se van a obtener tasas de supervivencia superiores al 50%. La solución de congelación será medio estándar de espermatozoide, tampón pH, antibióticos y crioprotectores como el glicerol o la yema de huevo. Para la descongelación de las muestras se va a realizar a temperatura ambiente. Además se realizará un lavado con medio de cultivo y una incubación a 37 grados para una recuperación de la movilidad (esto último de forma opcional).
Criopreservación de embriones
En primer lugar es necesario aclarar unos conceptos clave:
- Su tasa de supervivencia va a ser inferior a la de los espermatozoides.
- Sólo se podrá llevar a cabo con un congelador programable y un buen protocolo.
- Cuando un embrión sobrevive sus posibilidades de implantar van a ser las mismas que en fresco.
La congelación de los embriones se va a llevar a cabo con los embriones sobrantes de un tratamiento de reproducción asistida. De esta forma, las pacientes podrán en un futuro someterse a la transferencia de más embriones o podrán donarlos, tanto para otras parejas como para la investigación.
La criopreservación de embriones en división debe realizarse preferentemente en estados exponenciales de mitosis, es decir, cuando los embriones presentan 2,4,8 células. Esto es debido a que la respuesta de la célula al procedimiento de criopreservación varía durante el ciclo celular. En estados intermedios de clivaje algunas células se pueden encontrar en distintas etapas de división, incluso con el huso mitótico ensamblado. De modo que es posible provocar daños a nivel cromosómico puesto que las bajas temperaturas afectan a dicho huso.
La solución empleada en la congelación consta de un crioprotector llamado PROH, el cual está preparado en buffer fosfato alcalino (PBS) suplementado con un 20% de proteína y sacarosa.
Referencias
Véase también
Categoría: Criogenia
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